ການກວດດ້ວຍເຕັກນິກ RT-PCR ແມ່ນຫຍັງ

 

            ຈາກປາຍປີ 2019, ໂລກຂອງພວກເຮົາໄດ້ພົບກັບພະຍາດອຸບັດໃໝ່, ເຫດການໃໝ່ທີ່ພວກເຮົາເກືອບຈະຕັ້ງໂຕບໍ່ທັນ “ພະຍາດໂຄວິດ-19” (ເວົ້າແບບງ່າຍໆ), ຈາກນັ້ນຈິ່ງມີຄໍາໃໝ່ອອກມາ... New normal (ທຸກທ່ານແປກັນເອງ, ຂ້າພະເຈົ້າຢ້ານແປບໍ່ຖືກ,​ ແຕ່ຂໍໃຫ້ທ່ານໄດ້ລອງສົມທຽບແຕ່ກ່ອນຍຸກຂອງໂຄວິດ ແລະ ຫລັງໂຄວິດ ແບບແຜນດຳລົງຊີວິດ ແລະ ການເຄື່ອນໄຫວສັງຄົມ ມັນມີການປ່ຽນແປງແບບໃດ)

          ທີ່ເຫັນໜັກສຸດ ກໍ່ຄືຝ່າຍຮັກສາສຸຂະພາບ, ເປັນຄວາມທ້າທາຍໃໝ່ຂອງພວກເຮົາ, ການຊອກຫາກໍລະນີ, ບົ່ງມະຕິ ແລະ ການປິ່ນປົວຮັກສາ... ທຸກຢ່າງເກືອບວ່າໃໝ່ທັງນັ້ນ. ຂ້າພະເຈົ້າຄິດວ່າ ວິຊາການຜູ້ໃດຊອກຄວາມຮູ້ອັນໃດໄດ້ທີ່ຈະເຮັດໃຫ້ພະຍາດນີ້ດັບສູນໄປ...(ຫລືຢ່າງໜ້ອຍກໍ່ບໍ່ມີໃຜຕາຍ) ຜູ້ນັ້ນຄວນເປັນວິລະບຸລຸດ ແລະ ສ້າງວິລະກຳປະຫວັດສາດຂອງໂລກເຮົາໃນສະຕະວັດນີ້.

ສິ່ງໜຶ່ງທີ່ຢາກຍົກມາເປັນບົດຄວາມທາງວິຊາການໃນ Blog ນີ້ ແມ່ນການກວດຫາເຊື້ອພະຍາດດັ່ງກ່າວ ດ້ວຍວິທີທາງ PCR (Polymerase Chain Reaction). ການກວດດ້ວຍເຕັກນິກ PCR ມັນໄດ້ເຂົ້າມາມີບົດບາດຢ່າງໃຫຍ່ຫລວງໃນວຽກງານການກວດຫາເຊື້ອໂຄວິດ ແລະ ມີຊື່ສຽງໃນສະຖານະການໂຄວິດປະຈຸບັນ. ແຕ່ຂ້າພະເຈົ້າຄິດວ່າ ຫລາຍຄົນເອີ້ນຕິດປາກ PCR, ແຕ່ມີຫລາຍໃນນັ້ນບໍ່ເຂົ້າໃຈວ່າມັນແມ່ນຫຍັງ, ທຳງານກັນແນວໃດ (ຂໍໂທດທີ່ເວົ້າຜິດ)

ເທັກນິກການກວດແບບ PCR ແມ່ນຖືກປະດິດຂຶ້ນໃນປີ 1983 ໂດຍນັກຊີວະເຄມີຊາວອາເມລິກາ ທ່ານ Kary Mullis ເຊິ່ງທ່ານເອງກໍ່ໄດ້ຮັບລາງວັນໂນເບວສາຂາເຄມີ (Nobel Prize in Chemistry) ຮ່ວມກັບ Michael Smith (ນັກຊີວະເຄມີ ແລະ ນັກທຸລະກິດ, ຊາວອັງກິດ-ການາດາ) ໃນປີ 1993

ກ່ອນຈະເຂົ້າເນື້ອໃນທາງວິຊາການນັ້ນ ຂ້າພະເຈົ້າຂໍທຳຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບຄວາມໝາຍຂອງ RT-PCR ເທື່ອລະຄໍາກັນກ່ອນ.

1. Polymerase ຫລື ຈະເອີ້ນໃຫ້ເຕັມແມ່ນ DNA Polymerase ເປັນເອນໄຊມ໌ທີ່ພົບໃນຈຸລັງຂອງສິ່ງທີ່ມີຊີວິດ, ມີໜ້າທີ່ສ້າງ DNA ສາຍໃໝ່ຕໍ່ຈາກ Primer ໂດຍການສຳເນົາ (Copy) ຈາກ DNA ຕັ້ງຕົ້ນ. ໜ້າທີ່ຕົ້ນຕໍແມ່ນຊ່ວຍເລັ່ງປະຕິກິລິຍາເຊື່ອມຕໍ່ Nucleotide ໃໝ່ເຂົ້າກັບ Primer.

- Primer (ຈະອອກແບບຮ່ວມກັບໂຕກວດຈັບ ຫລື Probe ທີ່ມີການຕິດສີ Fluorescence ໄວ້) ເປັນ DNA ເລື່ມຕົ້ນສາຍສັ້ນໆທີ່ມີລໍາດັບ base ເປັນຄູ່ທີ່ສອດຄ່ອງ (ສົມຄູ່) ກັບ DNA ທີ່ເປັນຕົ້ນແບບໃນການສັງເຄາະ DNA ສາຍໃໝ່ (ສົມມຸດ ຖ້າຢາກຮູ້ວ່າໃນຕົວຢ່າງມີ DNA ຂອງພະຍາດ ຫລື ສິ່ງໃດໜຶ່ງ,​ ຕົວຢ່າງ ໄວຣັດໂຄວິດ, ເຮົາຕ້ອງສ້າງ Primer ທີ່ມີລໍາດັບຄູ່ base ໃຫ້ສົມຄູ່ກັບລຳດັບຄູ່ base ຂອງເຊື້ອໄວຣັດໂຄວິດ. ຖ້າຕົວຢ່າງຫາກມີເຊື້ອໄວຣັດໂຄວິດຢູ່, ຄູ່ base ຂອງ primer ຈະເຂົ້າໄປຈັບຄູ່ກັບ base ຂອງ DNA ຂອງເຊື້ອໄວຣັດ, ຈາກນັ້ນກໍ່ຈະມີການເພື່ມຈໍານວນຂຶ້ນຈົນສາມາດແປຜົນໄດ້)

- ລະວັງເຂົ້າໃຈຜິດ: ໃນຄວາມໝາຍພາສາອັງກິດທົ່ວໄປ, Primer ແມ່ນ ແປ້ງຮອງພື້ນ (ຫລື ຄຣີມຮອງພື້ນ) ເພື່ອປັບປຸງພື້ນຜິວໜັງ (ໂດຍສະເພາະໜ້າ) ກ່ອນການແຕ່ງໜ້າ, ໂດຍມັນຈະເຮັດໃຫ້ຮູຂຸມໃນໜ້ານ້ອຍລົງ, ຜິວໜ້າຂາວ-ໃສ ແລະ ຮອງພື້ນຕິດທົນນານ.

- ຄູ່ Base: ສາຍ DNA (Deoxyribonucleic Acid) ເປັນສາຍ Polynucleotide ສອງສາຍທີ່່ກ້ຽວກອດກັນໂດຍອາໃສຄູ່ Base ທັງສອງສາຍຈັບກັນຕາມຄູ່: Adenine (A) ຈັບຄູ່ກັບ Thymine (T) ແລະ Guanine (G) ຈັບຄູ່ກັບ Cytosine (C). ການຈັບກັບຂອງຄູ່  base ຈະສະຫລັບກັນໄປ ແລະ ເປັນໜຶ່ງດ່ຽວ, ເຊິ່ງເຫດຜົນດັ່ງກ່າວ DNA ຂອງສິ່ງທີ່ມີຊີວິດທັງຫລາຍຈິ່ງບໍ່ຄືກັນໄດ້.

2. Chain Reaction ແປຕາມໂຕບັນດາທ່ານ, ຄືປະຕິກິລິຍາທີ່ເກາະກາຍກັນໄປ, ເໝືອນຕ່ອງໂສ້ຫັ້ນແລະທ່ານ, ຜົນຈາກປະຕິກິລິຍາໜຶ່ງຈະໄປຮ່ວມທຳປະຕິກິລິຍາອີກ.....ເລື້ອຍໆໄປ.

3. RT (Real Time) ບໍ່ມີຄວາມໝາຍທາງເຕັກນິກ, ແປຕາມພາສາອັງກິດ: ເວລາຈິງ, ໃນຄະນະນັ້ນ...(ປະມານນີ້)

ເມື່ອແປລວມກັນ (ເປັນຄວາມໝາຍດ້ານເຕັກນິກ) ແມ່ນປະຕິກິລິຍາທີ່ເປັນຕ່ອງໂສ້ຂອງເອນໄຊມ໌ Polymerase, ແມ່ນເຕັກນິກທີ່ໃຊ້ໃນການເພື່ມຈໍານວນ (amplification) DNA ທີ່ຕ້ອງການສຶກສາຢ່າງຈໍາເພາະ ແລະ ສາມາດຕິດຕາມປະລິມານການເພື່ມຈໍານວນຂອງ DNA ເປົ້າໝາຍໄດ້ໃນທຸກໆຮອບຂອງການເພື່ມຈໍານວນໃນຂະນະທີ່ປະຕິກິລິຍາກຳລັງດຳເນີນຢູ່ ຕັ້ງແຕ່ເລື່ມຕົ້ນຈົນຊິ້ນສຸດປະຕິກິລິຍາ (Real time detection)

ປະຕິກິລິຍາຕ່ອງໂສ້ Polymerase ຈະເປັນການຄວບຄຸມອຸນະພູມໃນ 3 ຂັ້ນຕອນ (1 ຮອບ), ຄື:

1. Denaturation ເປັນຂັ້ນຕອນການຄາຍກ່ຽວຂອງສາຍ DNA (ໃຊ້ອຸນະພູມ 92-95 ອົງສາ C)

2. Annealing ເປັນຂັ້ນຕອນການຈັບຂອງ Primer ກັບສາຍ DNA ຕົ້ນແບບ (ໃຊ້ອຸນະພູມ 37-60 ອົງສາ C)

3. Extension ເປັນຂັ້ນຕອນການສ້າງສາຍ DNA ສາຍໃໝ່ ໂດຍໃຊ້ເອນໄຊມ໌ DNA Polymerase (ໃຊ້ອຸນະພູມ 72-75 ອົງສາ C)

ເມື່ອກວດພົບ DNA ເປົ້າໝາຍ, Probe ທີ່ມີການຕິດສີ Fluorescence ໄວ້ ຈະເຮືອງແສງອອກມາ, ໂດຍປະລິມານສັນຍານເຮືອງແສງທີ່ປ່ອຍອອກມານີ້ ຈະເປັນສັດສ່ວນໂດຍກົງກັບປະລິມານ DNA ທີ່ເພືີ່ມຂຶ້ນຈາກປະຕິກິລິຍາໃນແຕ່ລະຮອບ.

 DNA ທີ່ເພື່ມຈາກປະຕິກິລິຍາ PCR ຈະເພື່ມເປັນລັກສະນະກຣາບຮູບໂຕ S (Exponential curve), ໂດຍແກ່ນ Y ສະແດງສັນຍານການເຮືອງແສງ ແລະ ແກ່ນ X ສະແດງຈໍານວນຮອບຂອງການເພື່ມຈໍານວນ

ຂໍ້ມູນທີ່ແນ່ນອນໃນການກວດພົບ DNA ແລະ ໃຊ້ໃນການແປຜົນແມ່ນ ການສະແດງຈໍານວນຮອບໃນຊ່ວງຂອງ Exponential phase ເຊິ່ງເປັນຊ່ວງທີ່ມີລະດັບສັນຍານເຮືອງແສງສູງເໜືອລະດັບ Threshold ແລະ ມີແນວໂນ້ມໃນການເພື່ມຈໍານວນແບບທະວີຄູນ (Exponential) ເທົ່ານັ້ນ. (ຂ້າພະເຈົ້າຈະມາພົບກັບທ່ານອີກກ່ຽວກັບຄ່າ Ct ຫລືື Cycle Threshold ໃນ Blog ໜ້າ)

ສຳລັບເຄື່ອງມືຫລັກໃນການກວດໂດຍເຕັກນິກ RT-PCR ແມ່ນ Thermal Cycler ຫລື PCR Machine. ຕາມທີ່ຊື່ຂອງເຄື່ອງບອກໄວ້, ເຄື່ອງດັ່ງກ່າວນີ້ເປັນເຄື່ອງປັບປ່ຽນອຸນະພູມເປັນຂັ້ນຕອນຕາມທີ່ຕັ້ງໄວ້ ແລະ ທຳງານໝູນວຽນກັນຫລາຍຮອບ, ໂດຍມີການຕັ້ງຄ່າໃນ 3 ຂັ້ນຕອນ (Denaturation, Annealing ແລະExtension). ສ່ວນຫລາຍການເພື່ມປະລິມານ DNA ແມ່ນຢູ່ໃນລະຫວ່າງ 25 ຫາ 40 ຮອບ ແລະ ຈະໃຊ້ເວລາທັງໝົດ 1,5 ຫາ 5 ຊົ່ວໂມງ.

ຈົບສຳລັບເລື່ອງຂອງ PCR ສະບັບທົ່ວໄປ, ສັ້ນໆ, ເຂົ້າໃຈງ່າຍ, ໂອກາດໜ້າ ຂ້າພະເຈົ້າຈະເກັບເອົາເລື່ອງຄ່າ Ct ມາຄົ້ນຄວ້າກັບທ່ານ. ເຖິງແມ່ນວ່າ ທ່ານຈະສົນໃຈຜົນການກວດຈາກ PCR ວ່າອອກບວກ (ພົບ) ຫລື ລົບ (ບໍ່ພົບ), ແຕ່ຄ່າ Ct ມັນສາມາດໃຫ້ທ່ານບາງລາຍລະອຽດ ແລະ ໝູນໃຊ້ມັນໄດ້, ໂດຍສະເພາະການຕິດຕາມຜູ້ຕິດເຊື້ອໂຄວິດ, ພົບກັນ Blog ໜ້າ.